光學(xué)顯微鏡的主要觀察方法之熒光觀察

應(yīng)用專家 易海英

熒光現(xiàn)象

熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下，幾乎同時發(fā)射出波長更長光的過程(圖1)。當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射一個分子(如熒光團(tuán)中的分子)時，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10^-9–10^-8秒，在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③，會釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。

熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時間為熒光壽命，一般為納秒級別，是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM)，可以在熒光強(qiáng)度成像之外，更加深入地進(jìn)行功能性準(zhǔn)確測量，獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。

熒光的另一個重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長差異（圖2）。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前，電子經(jīng)過弛豫過程會損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

圖2：Stokes位移

熒光顯微鏡及熒光濾塊

熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等。

細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光，想要觀察它們，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多，可以直接標(biāo)記（比如使用DAPI標(biāo)記DNA），或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色，也可以用熒光蛋白（如GFP，綠色熒光蛋白）標(biāo)記目標(biāo)蛋白，還可以用可逆結(jié)合的合成染料（如Fura-2）等。

圖3：Leica DMi8倒置熒光顯微鏡及濾片轉(zhuǎn)輪

目前熒光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標(biāo)配成像設(shè)備，是我們?nèi)粘嶒灥暮脦褪帧晒怙@微鏡主要分為三大類：正置熒光顯微鏡（適合切片）、倒置熒光顯微鏡（適合活細(xì)胞，兼顧切片）、熒光體視鏡（適合較大標(biāo)本，如植物、斑馬魚（成體/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。

熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件，由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成，安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里，如Leica DMi8配有6位濾片轉(zhuǎn)輪（圖3）。不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會有區(qū)別，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。

濾塊在熒光成像中起著重要作用：激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品，阻擋其他波長的光；通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡（其作用是反射激發(fā)光和透射熒光），反射后通過物鏡聚焦，照射到樣品，激發(fā)出對應(yīng)的熒光即發(fā)射光，發(fā)射光被物鏡收集，透過二向分光鏡，到達(dá)發(fā)射濾片。如圖4中：激發(fā)波長為450-490nm，二向分光鏡反射短于510nm的光、透過長于510nm的光，發(fā)射光接收范圍為520-560nm。

圖4：熒光顯微鏡光路圖

熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長通（long pass，簡稱LP）和帶通（band pass，簡稱BP）兩種類型。帶通通常由中心波長和區(qū)間寬度確定，如480/40表示可通過460-500nm的光。長通濾色片如515 LP，表示可以通過波長長于515nm的光（圖5）。

圖5：FITC光譜曲線及濾片

熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)（吸收）曲線和發(fā)射曲線，激發(fā)峰為理想激發(fā)波長（激發(fā)效率高，從而可以降低激發(fā)光能量，保護(hù)細(xì)胞和染料），發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長范圍。因此，在實驗中，我們會盡可能選擇與激發(fā)峰接近的波長進(jìn)行激發(fā)，而接收范圍需包括發(fā)射峰。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm，在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片。

圖6：Alexa Fluor 488光譜曲線

濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到匹配樣品的濾塊對于熒光成像有著至關(guān)重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會注明，也可在網(wǎng)上查閱。

濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長，對于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源，目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)?，以及近年來飛速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的，在不同波段能量也會不同。LED光源因為其相對較窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點，正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。

除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊，還有外置快速轉(zhuǎn)輪（圖7），徠卡的外置快速轉(zhuǎn)輪相鄰位置濾片轉(zhuǎn)換速度為27ms，可實現(xiàn)高速多色實驗，如FRET及Fura2比例鈣成像（圖8）等。

圖7：徠卡外置快速轉(zhuǎn)輪EFW 

圖8：鈣成像，F(xiàn)ura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats. Courtesy of: Drs. Kazunori Kanemaru and Masamitsu Iino, Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

豐富多樣的熒光顯微成像技術(shù)

為了滿足不同的熒光成像需求，除熒光顯微鏡外，還發(fā)展出了各種熒光顯微成像解決方案：

• 寬場高清成像系統(tǒng)，如Leica THUNDER Imager，采用Leica創(chuàng)新的Clearing技術(shù)，在成像時高效去除非焦平面干擾信號，呈現(xiàn)清晰圖像，同時兼有高速成像的優(yōu)點；
• 共聚焦激光掃描顯微鏡，利用針孔排除非焦平面干擾，實現(xiàn)光學(xué)切片，得到高清圖像及三維立體圖像；
• 突破衍射極限的超高分辨率顯微鏡及納米顯微鏡，可對小于200nm的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察；
• 利用多光子激發(fā)原理進(jìn)行厚組織及活體深層成像的多光子成像系統(tǒng)；
• 具有高時空分辨率的光片成像技術(shù)，成像速度快、分辨率高、光毒性低，特別適合進(jìn)行發(fā)育、活體動態(tài)觀察等研究；
• 熒光壽命成像(FLIM），不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響，能更加深入地進(jìn)行功能性準(zhǔn)確測量；
• 熒光相關(guān)光譜(FCS)及熒光互相關(guān)光譜(FCCS），測量熒光分子的分子數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)，從而分析分子濃度、分子大小、粘性、分子運(yùn)動、分子結(jié)合/解離、分子的光學(xué)特性等；
• 全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)，*的z軸分辨率，非常適合細(xì)胞膜表面的分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)研究。

熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛，種類豐富，而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn)，大家可以選擇適合的技術(shù)去完成自己的研究。