當需要以納米級分辨率觀察樣品超微結(jié)構時,科學家通常借助電子顯微鏡(觀察表面結(jié)構的掃描電鏡 SEM 和觀察內(nèi)部結(jié)構的透射電鏡 TEM)——它們是當前科研界可使用的大顯微成像工具。
電鏡成像要求對樣品進行通常 20-150 nm的超薄切片,使用超薄切片機切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且無人為干擾因素,因此可以滿足電鏡成像對制備樣品的嚴苛要求。如果大量超薄切片具有樣品結(jié)構的前后連續(xù)性,SEM 成像采集的圖像就可以進行樣品內(nèi)部結(jié)構的 3D 重建,形成可用于分析的完整超微、精細立體圖像,即連續(xù)斷層成像技術(Array Tomography, AT)。
今天,小編簡要介紹一下 AT 成功的關鍵環(huán)節(jié):連續(xù)超薄切片樣品制備。
超薄切片之重要性
AT 常用于細胞、蛋白質(zhì)等生物 / 生物大分子結(jié)構的納米分辨率、3D 結(jié)構觀察和分析,主要步驟為包埋樣品連續(xù)(超?。┣衅EM / SEM 或光學顯微鏡對其進行成像、對獲得的一系列圖像進行重建分析。AT 可以獲得的有效信息包括超微結(jié)構的定量、體積分析和細胞 / 蛋白的形態(tài)學數(shù)據(jù)等,相較于共聚焦顯微鏡獲得的圖像,具有更高的水平和空間分辨率(可達 0.2 nm)。
超薄切片主要用于 TEM 成像前的樣品制備,以納米分辨率觀察樣品內(nèi)部結(jié)構信息。無污染且獲取快速的超薄切片的主要優(yōu)勢在于:
· 整個切片均可用于電鏡成像,適合大尺寸樣品分析;
· 單張切片電子透射均一性好,保證結(jié)果可靠性;
· 制備速度快,短時間即可獲得大量切片;
· 適用樣品范圍廣,生物樣本和工業(yè)材料均適用。
超薄切片的基本原理
對于 TEM 或者 3D 結(jié)構重建,樣品高質(zhì)量連續(xù)切片是前提。因此,一臺如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D(20-50 nm)(見圖 1)一樣穩(wěn)定可靠的超薄切片機是開展實驗的*工具。
▲圖 1. Leica 連續(xù)超薄切片機新品 —— EM ARTOS 3D
樣品被安裝在可上下前后準確移動的電動機械臂上,機械臂垂直上下移動、遇到固定的玻璃刀或鉆石刀時,一條樣品帶被切下(圖 2),然后刀臺自動向左移動,按照設定的切片厚度完成第二條切割。同理,隨后刀臺再向左移動,完成第三條切割(圖 3)。從刀片上直接取下切片是十分困難的,因為它非常薄且脆弱,徠卡超薄切片機采用溫和水流托舉的方式使條帶不斷分離,能夠保證條帶質(zhì)量不被破壞同時操作極其簡單(冷凍切片情況可借助顯微操作),然后進行上電鏡前的其它必要處理。
▲ 圖 2. EM ARTOS 3D 超薄切片機樣品切割位置基本結(jié)構
▲ 圖 3. EM ARTOS 3D 制備的連續(xù)超薄切片條帶
連續(xù)斷層成像的樣品制備
多數(shù)未處理的生物樣品比較柔軟,AT 成像前的樣品制備主要包括下面幾個步驟:
· 組織固定
· 樣品水分抽提和包埋
· 連續(xù)切片和切片條帶收集
· 切片染色以用于成像(如果需要)
后使用 SEM 或光學顯微鏡(通常熒光成像情況)對結(jié)構上具有連續(xù)性的切片進行成像,合成圖像以進行 3D 重建和分析。
對于市面上多數(shù)超薄切片機,使用者在 AT 成像的樣品制備時,通常會發(fā)現(xiàn)這是一項耗時耗力、中間一些操作必須手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 連續(xù)超薄切片機,能夠自動化連續(xù)切片、顯著縮短樣品制備時間、減少人工操作、切片無褶皺、厚度均一、溫和水流取條帶、提高樣品制備成功率等眾多優(yōu)點,在向下兼容普通超薄切片需要的同時,特別合適高通量切片和 AT 等前沿研究對樣品制備的嚴苛要求。
數(shù)據(jù)展示
▲ 圖 4. AT 技術獲得的鼠淋巴結(jié) 3D 結(jié)構重建
來自:Science and Technology (IST) Austria, Klosterneuburg
相關文獻:
1. Variety of RNAs in Peripheral Blood Cells, Plasma, and Plasma Fractions
2. High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning
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