DMi8與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究
——如何為您的研究選擇和配置顯微鏡
新冠也許是人類已知的作為危險的病毒之一,其傳播力強、途徑隱秘危害性大,而面臨如此大敵,多虧了核酸檢測技術(shù)發(fā)展才可以使其無所遁形。但是核酸檢測技術(shù)首先都需要對核酸中的信號進行放大,以新版的國家新冠指南中所描述,需要將收集到的DNA進行35個循環(huán)的擴展后才可以用于檢測,這個參數(shù)雖然較之之前的40個循環(huán)有所減少,但是放大倍數(shù)也有235之多,可以想象如果中間有任何錯誤都會被放大如此高的倍數(shù)。怎么樣才能測得準確呢?標準品是關(guān)鍵的保證之一。
面對新冠的核酸檢測方案中的標準品,上海交通大學(xué)的樊春海院士在此方面做出了最關(guān)鍵的貢獻。2020年初在他主持下的國家轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科學(xué)中心積極支持下,上海市計量院與交大的聯(lián)合團隊夜以繼日攻關(guān),僅用42天及時研發(fā)出新冠核酸標準物質(zhì)——GBW(E)091111和GBW(E)091112,并經(jīng)國家緊急授權(quán)于2020年3月19日獲批,為核酸試劑盒提供計量溯源和質(zhì)量控制依據(jù),供百余家研制單位使用,為疫情防控做出重要貢獻和基礎(chǔ)保障。擁有170年光學(xué)技術(shù)沉淀的徠卡顯微系統(tǒng)也非常有幸能為樊院士的研究提供力所能及的支持。
圖片轉(zhuǎn)載自“上海科技”公眾號,作者:一諾
工欲善其事必先利其器,在成就偉大的科研成果之前,對設(shè)備的配置選擇是首要因素之一。光學(xué)顯微鏡通常是生命科學(xué)研究實驗室的主要設(shè)備之一。它可在多種應(yīng)用中幫助解開科學(xué)謎團。因此,從明場顯微鏡到熒光顯微鏡和活細胞成像,顯微鏡的配置和功能對于其應(yīng)用范圍至關(guān)重要。
您研究什么樣本?
選擇研究顯微鏡時,首要的考慮因素是研究的樣本類型。如果是放置在薄載玻片上的固定樣本,您可以選用正置顯微鏡。活細胞檢測則需要使用顯微鏡的特殊功能,因為它們是放在充滿細胞培養(yǎng)液的大細胞培養(yǎng)容器中。
圖1:左:放置固定樣本的載玻片,例如組織切片。右圖:用于細胞培養(yǎng)的有蓋培養(yǎng)皿。
只有物鏡在樣本下方而聚光鏡在樣本上方的倒置配置,才能提供基本的自由空間和物鏡與樣本之間的接近度。與此同時,倒置顯微鏡還可以很好地接近細胞,例如添加顯微操縱器。
此外,活細胞需要適當(dāng)?shù)沫h(huán)境才能生存。溫度和二氧化碳濃度必須保持在一定水平。完成這項任務(wù)需要一個帶有相應(yīng)控制器的氣候室。
圖2:左:正置顯微鏡的特點是物鏡在樣本上方,聚光鏡在樣本下方。右:倒置顯微鏡的設(shè)置恰好相反,主要是為了向用戶提供更多空間以及物鏡與樣本之間所需的接近度。
您認為是在哪些維度?
顯微樣本展開成三個維度:長度、寬度和高度。一些樣本,例如組織切片,僅在xy方向上成像,而其他應(yīng)用可能也需要在z方向上進行采集。成像3D體積,例如,對于活細胞,建議使用電動物鏡轉(zhuǎn)盤,它能夠逐步引導(dǎo)您的樣本通過焦點。成像軟件應(yīng)該能夠重建單個圖像以進行3D可視化。
對于活細胞,您必須添加時間維度。在這種情況下,系統(tǒng)穩(wěn)定性便是另一個關(guān)鍵特性。由于在采集過程中溫度變化會影響成像系統(tǒng),因此必須采取有效的應(yīng)對措施。自適應(yīng)對焦控制(AFC)等自動對焦調(diào)整可消除這些熱影響,并始終找到預(yù)定義的焦點。
圖3:自適應(yīng)對焦控制(AFC)也可以在長時間延時采集期間自動穩(wěn)定顯微鏡焦點。傳感器檢測到LED光束(850 nm)的運動,如果載有樣本的蓋玻片改變其位置,例如由于熱活動,就會發(fā)生這種運動。
哪種對比方法適合您的樣本?
用顯微鏡研究的大多數(shù)細胞——尤其是動物細胞——沒有足夠的內(nèi)在對比度來讓研究人員觀察細節(jié)。研究人員使用對比方法來解決這個問題。相襯(PH)和微分干涉對比(DIC)可操縱穿過樣本的光以增加對比度,您也可以分別使用熒光蛋白通過熒光染料(免疫熒光)對其進行染色。
根據(jù)對比方法,顯微鏡需要特定的設(shè)備;例如相襯需要特殊的物鏡,而DIC使用某些必須切換到光路中的棱鏡。對于熒光顯微鏡,您需要特殊的熒光濾色塊,以促使正確的光波長進入和退出樣本。
圖4:用不同對比方法獲得的一系列神經(jīng)元細胞。從左到右:明場、DIC、相襯、熒光
光源呢?
對比方法的選擇也決定了光源。用于傳統(tǒng)明場顯微鏡、相襯和DIC的透射光照明可以使用鹵素或LED照明進行。熒光顯微鏡可以通過LED照明或在汞燈、氙燈或汞金屬鹵化物燈的幫助下進行。
您想記錄或發(fā)布您的結(jié)果嗎?
如果您想拍攝樣本圖像或進行活細胞成像,則需要一個數(shù)碼顯微鏡攝像頭。特別是在熒光活細胞成像的情況下,建議使用靈敏的攝像頭,以盡量減少可能傷害細胞的激發(fā)光量。除了成熟的CCD和EMDDC攝像頭外,如今的sCMOS攝像頭也因其高量子效率和采集速度而得到應(yīng)用。有關(guān)數(shù)碼顯微鏡攝像頭的更多信息,請閱讀文章“數(shù)碼攝像頭技術(shù)簡介”。
此外,大視野(FOV)有助于更快地找到感興趣的區(qū)域并同時成像更多細胞?,F(xiàn)代研究顯微鏡的攝像頭端口具有19毫米FOV,與19毫米sCMOS攝像頭芯片匹配。
通常,僅拍攝樣本圖像是不夠的,還需要分析您獲得的數(shù)據(jù)。為此,易于使用的成像和分析軟件有助于獲取定量數(shù)據(jù)并進行可靠的數(shù)據(jù)分析。
您是否需要采集厚樣本的(3D)信息?
厚樣本對顯微鏡檢查來說是一個挑戰(zhàn)。尤其是寬場顯微鏡在同時照亮整個樣本的情況下,來自焦點外區(qū)域的額外光會顯著減少焦點內(nèi)的樣本特征。
成像解析可以幫助獲得沒有失焦光的圖像。該技術(shù)可以應(yīng)用于單個圖像平面以獲得即時結(jié)果(ICC:即時成像解析),或者可以與額外的反卷積步驟(SVCC:小容量成像解析;LVCC:大容量成像解析)以獲得更好的結(jié)果。反卷積將光子信息重新分配給它們的起源,從而在焦平面中提供更好的所需結(jié)構(gòu)對比度。與傳統(tǒng)的寬場圖像相比,這可以讓用戶更容易地將感興趣的結(jié)構(gòu)與背景區(qū)分開來。
圖5:癌組織中的單分子RNA-FISH。RNA-01(綠色)、RNA-02(品紅色)左:原始數(shù)據(jù)。中:使用即時成像解析。右圖:大容量成像解析之后。由蘇黎世大學(xué)(瑞士)的Andreas Moor教授提供。
您想在顯微鏡上操作細胞嗎?
在過去的幾年里,樣本的圖像處理變得日益普遍。這意味著研究人員不僅要觀察活細胞,還要借助光來操縱它們。光漂白后的熒光恢復(fù)(FRAP)是有助于了解動態(tài)細胞過程的一個示例。對于這些類型的操作技術(shù),通常需要額外的光源,這些光源必須集成到顯微鏡的光路中。
這種方法并非易事。徠卡無限端口是一種通用解決方案,可將附加光源耦合到顯微鏡的光路中,而不會影響圖像質(zhì)量,例如:FRAP、光開關(guān)、消融或光遺傳學(xué)。有了合適的適配器,研究人員甚至可以連接他們的自制設(shè)備。
圖6:徠卡WFFRAP模塊(左側(cè)黑框)可通過無限端口與倒置研究顯微鏡徠卡DMi8連接。
您的預(yù)算是多少?
一個重要的問題是您可以投入的資金。一些顯微鏡供應(yīng)商提供適合特殊應(yīng)用的預(yù)定義配置。但是,如果您不需要所有付費的預(yù)配置組件怎么辦?這就是為什么免費配置組件比購買預(yù)定義的顯微鏡系統(tǒng)更經(jīng)濟的原因。
此外,對顯微鏡的要求可能會隨著時間而改變。在這種情況下,可升級系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。通過預(yù)定義和固定的配置,您會發(fā)現(xiàn)僅需有限數(shù)量的應(yīng)用程序。可升級性讓您可以根據(jù)不斷變化的需求靈活配置。
考慮到這些因素,徠卡DMi8等模塊化顯微鏡平臺可以使研究人員從經(jīng)濟的顯微鏡系統(tǒng)入門,然后隨著需求的增長而不斷升級。
圖7:利用模塊化設(shè)計,徠卡DMi8可以根據(jù)研究人員的需要進行配置。此外,如果需求發(fā)生變化,后期還可以進行升級。
誰使用顯微鏡?
顯微鏡用戶的范圍可能差異很大。尤其是在大學(xué),用戶可能非常有經(jīng)驗,也可能是絕對的初學(xué)者。因此,由徠卡應(yīng)用套件X(LAS X)等直觀軟件運行的易于使用的顯微鏡系統(tǒng)有助于人們快速入門并快速獲取數(shù)據(jù)。例如,面向工作流的設(shè)計、圖像分析向?qū)б约皩⑼鈬O(shè)備無縫集成到系統(tǒng)中可以簡化您的工作。
除了寬場研究顯微鏡外,體視顯微鏡也經(jīng)常用于生命科學(xué)研究實驗室。您可以在“選擇體視顯微鏡時要考慮的因素”一文中了解更多信息。
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