高效的長(zhǎng)期延時(shí)拍攝技術(shù)

研究球狀體的形成

當(dāng)對(duì)球狀體做延時(shí)拍攝技術(shù)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)某些挑戰(zhàn)。由于實(shí)驗(yàn)可能持續(xù)數(shù)天，必須實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的樣本存活，這就需要確保接近生理?xiàng)l件。本文描述的長(zhǎng)期延時(shí)研究使用了全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)MICA來(lái)研究U343和MDCK細(xì)胞球形成。細(xì)胞球生長(zhǎng)需要最佳條件，以確保細(xì)胞周期和增殖不受干擾。

圖像：每孔1000個(gè)被穩(wěn)轉(zhuǎn)了MX1 GFP（綠色）的MDCK細(xì)胞形成的3D細(xì)胞球。72小時(shí)延時(shí)拍攝，間隔30分鐘?；疑荌MC。

延時(shí)拍攝技術(shù)

延時(shí)拍攝技術(shù)[1,2] 是指在一定的時(shí)間內(nèi)，通過(guò)顯微鏡以特定的速率（通常為幀/秒（fps））捕捉標(biāo)本的圖像

如果圖像捕獲率低于用于觀察記錄圖像的觀察率，那么在觀察像視頻一樣的圖像序列時(shí)，時(shí)間就會(huì)顯得更快。同樣，如果圖像捕獲率高于觀察率，那么時(shí)間似乎就會(huì)變慢。因此，延時(shí)顯微鏡檢查能夠觀察到長(zhǎng)時(shí)間的微觀事件，即在幾分鐘、幾小時(shí)或幾天內(nèi)發(fā)生的事件，在幾秒鐘、幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)就能看到。延時(shí)顯微鏡檢查用于研究活體標(biāo)本，如細(xì)胞培養(yǎng)物、急性組織樣本和模式生物隨著時(shí)間的推移而生長(zhǎng)和發(fā)展，以獲得更多關(guān)于生物過(guò)程的見(jiàn)解[3,4]。

例如，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中，細(xì)胞遷移對(duì)多細(xì)胞生物體非常重要。為了準(zhǔn)確跟蹤細(xì)胞和生物體隨時(shí)間的變化，可以采用“縱向"研究[5] ，即在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，在特定的條件下觀察同一樣本或標(biāo)本。

細(xì)胞球

細(xì)胞球是一種三維細(xì)胞培養(yǎng)，就像類(lèi)器官一樣，它模擬活體組織和器官的生理功能[6]。單層二維細(xì)胞培養(yǎng)物通常是在基質(zhì)上平坦生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞球和其他3D細(xì)胞培養(yǎng)物則可以大量生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞之間的三維相互作用，這更像有機(jī)體中的原生組織。這些3D細(xì)胞培養(yǎng)物可用于研究，以幫助更好地了解更真實(shí)的微環(huán)境中的細(xì)胞。細(xì)胞球在神經(jīng)科學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及癌癥和心血管研究方面的應(yīng)用非常有用。

挑戰(zhàn)

當(dāng)用細(xì)胞球做延時(shí)顯微鏡拍攝時(shí)，會(huì)出現(xiàn)某些挑戰(zhàn)。由于實(shí)驗(yàn)可能持續(xù)數(shù)天、甚至數(shù)周，因此必須在保證接近生理?xiàng)l件的情況下，延長(zhǎng)樣品的存活時(shí)間。熒光標(biāo)記物的表達(dá)必須保持在內(nèi)源性水平，以防止損害細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

培養(yǎng)基中必須有穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和濃度不變的物質(zhì)，否則這種物質(zhì)的濃度可因蒸發(fā)而降低。長(zhǎng)時(shí)間的正確成像要求顯微鏡成像保持聚焦，并適應(yīng)不斷變化的樣品特征，如橫向和軸向生長(zhǎng)。

研究實(shí)驗(yàn)室可能沒(méi)有涉及3D細(xì)胞培養(yǎng)的延時(shí)顯微鏡工作所需的儀器。這種情況下，通常通過(guò)在多個(gè)研究小組和用戶間共享設(shè)施來(lái)解決，但這可能意味著在獲得所需儀器之前需要漫長(zhǎng)的等待時(shí)間。這些挑戰(zhàn)可能會(huì)導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果將影響根本性突破和獲得新的見(jiàn)解。

Mica介紹

MICA是全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個(gè)wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過(guò)使用這個(gè)成像分析平臺(tái)，您可以從以下方面受益：

人人皆享：輕松設(shè)置受控環(huán)境條件，匹配聚焦策略，并設(shè)置成像條件

機(jī)制簡(jiǎn)化工作流程：屏幕上注釋和提取多個(gè)參數(shù)

觸手可及：最佳的環(huán)境條件和多種成像模式（明場(chǎng)、寬場(chǎng)和共聚焦），以配合實(shí)驗(yàn)需要，以及水鏡和聚焦策略的智能自動(dòng)化

方法

這項(xiàng)長(zhǎng)期延時(shí)研究是使用MICA來(lái)研究從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MX1-GFP或 U343細(xì)胞開(kāi)始的細(xì)胞球的形成。細(xì)胞球生長(zhǎng)需要最佳的生理?xiàng)l件，確保細(xì)胞周期和增殖不受干擾[6,7]。

以往的研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)本身往往與特定的蛋白質(zhì)或細(xì)胞狀態(tài)和分化的某些標(biāo)記物的表達(dá)相關(guān)[6,7]。

圖1：圖示細(xì)胞隨時(shí)間而形成的細(xì)胞球。

MICA在這一關(guān)鍵應(yīng)用中作為一種培養(yǎng)箱，在接近生理?xiàng)l件下維持3D細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞球，并最大限度地減少培養(yǎng)基蒸發(fā)。MICA可幫助用戶測(cè)量細(xì)胞球的生長(zhǎng)并分析蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

圖2和圖3顯示了在3D細(xì)胞球的形成及其生長(zhǎng)的長(zhǎng)期延時(shí)研究中獲得的圖像和數(shù)據(jù)。

視頻 1：左半部分：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MX1-GFP的MDCK細(xì)胞（整合調(diào)制反差I(lǐng)MC[灰色]和熒光[綠色]），右半部分：野生型U343細(xì)胞（整合調(diào)制反差[灰色]）。圓底60孔多孔板間隔時(shí)間為30分鐘拍攝72小時(shí)的延時(shí)視頻。

圖2：對(duì)60個(gè)孔隨時(shí)間變化的分析：紅色表示經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的像素分類(lèi)器在60小時(shí)成像后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的區(qū)域。

圖3：上排：每孔1000個(gè)MDCK細(xì)胞形成3D細(xì)胞球的延時(shí)序列中選出的圖像，其中細(xì)胞用MX1 GFP（綠色）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這些圖像分別是在接種細(xì)胞后第0、11、20、40和61小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)拍攝的。圖中所示的紅色曲線是對(duì)形成的MDCK細(xì)胞球狀體大小的相應(yīng)測(cè)量。
下排：每孔1000個(gè)U343細(xì)胞形成3D細(xì)胞球的延時(shí)序列中選出的圖像。

這些圖像也是在接種細(xì)胞后第0、11、20、40和61小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)拍攝的。

圖中所示的綠色曲線是對(duì)形成的U343細(xì)胞球體大小的相應(yīng)測(cè)量。

參考資料

1. J.L. Collins, B. van Knippenberg, K. Ding, A.V. Kofman, Time-Lapse Microscopy, Ch. 3 in Cell Culture, Ed. R. Ali Mehanna (IntechOpen, London, 2018) ISBN: 978-1-78984-867-0, DOI: 10.5772/intechopen.81199.

2. Time-Lapse Microscopy: Technique and Significance, Looking at Cell Migration: What is Time-Lapse Microscopy (TLM)? Microscope Master.

3. Live-Cell Imaging Techniques Visualizing the Molecular Dynamics of Life, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

4. T. Veitinger, Introduction to Live-Cell Imaging, Science Lab (2012) Leica Microsystems.

5. R.R. Shields-Cutler, G.A. Al-Ghalith, M. Yassour, D. Knights, SplinectomeR Enables Group Comparisons in Longitudinal Microbiome Studies, Front. Microbiol. (2018) vol. 9, DOI: 10.3389/fmicb.2018.00785.

6. N. Kalebic, P. Kanrai, J. Kulhei, Observing 3D Cell Cultures During Development, ?Science Lab (2021) Leica Microsystems.

7. S.S. Nazari, Generating 3D spheroids with encapsulating basement membranes for invasion studies, Curr. Protoc. Cell Biol. (2020) vol. 87, iss. 1, e105, DOI: 10.1002/cpcb.105.