您好！歡迎訪問徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司網(wǎng)站！
全國(guó)服務(wù)咨詢熱線:
17806260618
17806260618
從成像到分析
Caspases與細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)，因此可以利用caspase檢測(cè)來(lái)確定細(xì)胞是否正在經(jīng)歷這種程序化的細(xì)胞死亡。這些檢測(cè)可以通過(guò)例如流式細(xì)胞儀、平板讀數(shù)儀實(shí)現(xiàn)，也可以在顯微鏡上完成，顯微鏡可為量化數(shù)據(jù)補(bǔ)充可見的結(jié)構(gòu)信息。在這篇文章中，我們描述了MICA是如何用于caspase 3/7測(cè)定。借助Navigator或像素分類器等工具，MICA讓設(shè)置、執(zhí)行和分析caspase 3/7檢測(cè)變得更加容易，即使沒有經(jīng)驗(yàn)的用戶也可輕松操作。
圖像：雙色caspase檢測(cè)并進(jìn)行拼接掃描。U2OS細(xì)胞用核標(biāo)記物DRAQ5（品紅）和CellEvent™（黃色）標(biāo)記。加入4mM星形孢菌素以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。20倍物鏡下使用雙通道熒光，持續(xù)16小時(shí)每30分鐘獲取一次2x2 FOV（視野范圍）的掃描拼接圖像。
凋亡細(xì)胞檢測(cè)或者活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)一般通過(guò)將某種物質(zhì)應(yīng)用于活細(xì)胞并觀察細(xì)胞反應(yīng)，以此檢測(cè)其毒性或有效性。死亡率隨時(shí)間推移而上升或者劑量依賴性上升均證明物質(zhì)有效。判斷潛在藥物的抗癌效果便是一個(gè)典型示例。
商用染料試劑盒可檢測(cè)處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。這些試劑盒內(nèi)染料為熒光染料，能夠分別標(biāo)記活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。
Caspase活性檢測(cè)法是細(xì)胞凋亡檢測(cè)法的一種。Caspase（半胱天冬酶）是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的一類半胱氨酸蛋白水解酶。它們還用于區(qū)分caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死。
這里的染料試劑盒使用的是DNA結(jié)合試劑，該試劑的熒光能夠被四氨基酸肽(DEVD)阻斷。一旦caspase-3和caspase-7（caspase-3/7）被激活，即當(dāng)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)時(shí)，caspase-3和caspase-7便會(huì)切割DEVD肽，然后DNA結(jié)合試劑便會(huì)開始呈現(xiàn)熒光（見視頻1）。
由于添加劑濃度不同、孵育時(shí)間不同、染色類型或者細(xì)胞系不同等參數(shù)的不同，實(shí)驗(yàn)通常在多孔板上進(jìn)行。這種方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是能夠在一個(gè)反應(yīng)容器中設(shè)置多個(gè)不同的試驗(yàn)條件，二是只需要極少量的試劑和極低數(shù)量的細(xì)胞。
但是，在實(shí)施過(guò)程中，用戶仍然可能會(huì)被不同孔和不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)量混淆。
設(shè)置多孔板實(shí)驗(yàn)時(shí)，MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預(yù)覽。包括可以在虛擬畫板上計(jì)劃并設(shè)置每一孔的掃描拼接實(shí)驗(yàn)或者延時(shí)實(shí)驗(yàn)（見圖1）。
追蹤細(xì)胞活動(dòng)需要使單一熒光通道的時(shí)空相關(guān)性成像。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡一般一次記錄一個(gè)通道，因此每一個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)只能按順序、一個(gè)接一個(gè)地記錄下來(lái)。這意味著兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)記錄于兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)。這對(duì)于極速發(fā)生的細(xì)胞事件來(lái)說(shuō)可能會(huì)產(chǎn)生影響，特別是在共定位研究中。
同時(shí)成像通過(guò)在同一時(shí)間記錄全部熒光的方法規(guī)避了這一缺點(diǎn)。對(duì)于caspase活性檢測(cè)法而言，這意味著用戶能夠觀察到，例如在caspase-3/7被激活的瞬間線粒體的反應(yīng)。
MICA甚至能夠同時(shí)檢測(cè)四種熒光，使用戶可以同時(shí)觀察到除細(xì)胞核、caspase-3/7活性、線粒體等之外的另一個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)（見圖5）。
最后，如果想要確定某一特定試劑在誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)的效果，則需要對(duì)caspase檢測(cè)進(jìn)行量化。這種量化需要通過(guò)專門的外部軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)。
MICA自帶分析解決方案，不需要另外的軟件。通過(guò)MICA自帶的像素分類器，用戶能夠標(biāo)記一些感興趣區(qū)域（ROI），人工智能算法通過(guò)這些標(biāo)記區(qū)域能夠檢測(cè)所有其他的感興趣區(qū)域（見圖2）。對(duì)于caspase活性檢測(cè)法而言，細(xì)胞核信號(hào)可用于確定細(xì)胞總數(shù)。CellEvent™信號(hào)可用于識(shí)別caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞
在這一案例研究中使用的檢測(cè)法中， U2OS細(xì)胞或者COS7細(xì)胞被鋪在96孔板，然后培養(yǎng)一整晚的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，活細(xì)胞分別用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后，更換培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前使用CellEvent™孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素（3 µM–7 µM）。
在四色caspase活性檢測(cè)法中，U2OS細(xì)胞被接種在96孔板上并在夜間生長(zhǎng)，然后培養(yǎng)一整晚的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，活細(xì)胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘。之后，更換培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前使用CellEvent™和SiR-Tubulin孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑—星形孢菌素（3 µM–7 µM）。
在37℃、5% CO2和~65%濕度的環(huán)境中，按照指示的時(shí)間間隔和持續(xù)時(shí)間用MICA進(jìn)行活細(xì)胞成像。使用Navigator工具設(shè)定并執(zhí)行檢測(cè)。一些實(shí)驗(yàn)中會(huì)運(yùn)行掃描拼接（參見視頻2）。進(jìn)行掃描拼接時(shí)，研究人員使用的主要策略是“focus Map”；此外，延時(shí)實(shí)驗(yàn)通過(guò)“Keep focus”來(lái)保持細(xì)胞的聚焦。
視頻 2：三色caspase活性檢測(cè)的掃描拼接片。U2OS細(xì)胞分別用核標(biāo)記SPY-650-DNA（藍(lán)色）、線粒體膜電位標(biāo)記TMRE（品紅）和CellEvent™（黃色）處理。加入5mM星形孢菌素以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。使用20x物鏡，在明亮視野和兩種熒光通道下，12小時(shí)內(nèi)每15分鐘獲取一次2x2 FOVs（視野范圍）的掃描拼接圖像。隨著時(shí)間增加，Caspase活性增強(qiáng)，線粒體活性減弱。
使用MICA自帶的分析功能進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)分析。其中核心組件之一便是人工智能驅(qū)動(dòng)的像素分類器，該功能位于“學(xué)習(xí)”選項(xiàng)。
通過(guò)像素分類器，用戶能夠標(biāo)記其感興趣區(qū)域（ROI），該區(qū)域?qū)⒆鳛樗幸獧z測(cè)的其他區(qū)域的示例。如圖5所示，細(xì)胞核被像素分類器標(biāo)記并檢測(cè)。像素分類器同樣能夠標(biāo)記并檢測(cè)線粒體活性標(biāo)識(shí)TMRE和caspase呈陽(yáng)性的細(xì)胞。之后會(huì)在整個(gè)延時(shí)攝影過(guò)程中分析這批圖像。
經(jīng)過(guò)計(jì)算之后，MICA會(huì)將計(jì)算結(jié)果以散點(diǎn)圖、共定位圖、直方圖、餅狀圖、框圖或者時(shí)間序列圖的形式展示在“結(jié)果”選項(xiàng)中。
SPY-650-DNA（標(biāo)記細(xì)胞核）和CellEvent™（標(biāo)記caspase 3/7活性）兩種細(xì)胞染料的量化研究揭示了在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡的細(xì)胞。細(xì)胞核的數(shù)量（此處選擇“范圍”參數(shù)做類比）說(shuō)明了每張圖像中細(xì)胞的數(shù)量（同選“范圍”），可與處于凋亡過(guò)程中細(xì)胞的數(shù)量（同選“范圍”）相對(duì)應(yīng)。另一個(gè)標(biāo)記，即TMRE成像過(guò)程，揭示了線粒體活性。
量化數(shù)據(jù)(如長(zhǎng)度、寬度、面積)顯示在采集圖像下方的表格中，這些數(shù)據(jù)可被導(dǎo)出為Excel表格。獲取的圖像可以在延時(shí)成像的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上查看，并可以與識(shí)別的ROI重疊。
三色caspase 3/7活性檢測(cè)圖（圖4）顯示，細(xì)胞核信號(hào)在開始的時(shí)候增強(qiáng)，之后逐漸減弱。信號(hào)增強(qiáng)是因?yàn)楹巳旧珓┍仨毰cDNA結(jié)合，這一結(jié)合過(guò)程需要一定的時(shí)間。另一方面，SPY-650-DNA信號(hào)減弱是因?yàn)榧?xì)胞核解體，解體現(xiàn)象見相關(guān)圖像。
其他信號(hào)要么隨時(shí)間增加而增強(qiáng)（CellEvent™），要么隨時(shí)間增加而減弱（TMRE）： caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)激活狀態(tài)的線粒體數(shù)量減少。
用戶可以通過(guò)MICA一次性對(duì)四種熒光成像。在caspase 3/7活性檢測(cè)法中，這有助于調(diào)查凋亡過(guò)程中額外的細(xì)胞成分的命運(yùn)—實(shí)現(xiàn)*時(shí)空相關(guān)性。圖5中展示的案例顯示，除了細(xì)胞核（DAPI）、激活狀態(tài)的線粒體（TMRE）以及caspase陽(yáng)性細(xì)胞（CellEvent™）以外，也對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架（SiR-Actin）進(jìn)行了染色。
高倍率下（63x），用戶能夠看到，caspase被激活之后，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架坍塌。與此同時(shí)細(xì)胞核以及線粒體停止工作。因?yàn)樗型ǖ蓝际窃谝淮闻臄z中獲得的，各細(xì)胞活動(dòng)成像之間存在精確聯(lián)系。
Caspase活性檢測(cè)法為研究抗癌藥物提供了新的見解。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員必須在保證高時(shí)空精準(zhǔn)度的情況下將活細(xì)胞從凋亡細(xì)胞中區(qū)分出來(lái)。
對(duì)于統(tǒng)計(jì)上可靠的結(jié)果，增加量很有必要。這就是為什么這類實(shí)驗(yàn)必須在孔板上進(jìn)行，也必須進(jìn)行量化研究。
MICA滿足以上全部要求。在FluoSync的幫助下，Mica可同時(shí)保證多達(dá)4種不同的熒光染料可以同時(shí)成像，不論是在單一培養(yǎng)皿上，還是在96孔板上。MICA完整的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠培育活細(xì)胞數(shù)日，同時(shí)其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶獲得可靠的數(shù)據(jù)。
地址：上海市長(zhǎng)寧區(qū)福泉北路518號(hào)2座5樓
郵箱：lmscn.customers@leica-microsystems.com
傳真：
電話
微信掃一掃
當(dāng)前位置：