樣品處理通常是光片顯微鏡研究中的一個關(guān)鍵話題。徠卡顯微系統(tǒng)的TCS SP8 DLS將光片技術(shù)集成到倒置共聚焦平臺中,因此可以利用關(guān)于樣品安裝和XY-stage功能的一般原則。本文將描述一組安裝框架,這些框架不僅允許準(zhǔn)備更多的樣品,尤其是在使用諸如BABB(苯甲醇苯甲酸酯)等潛在有害的安裝介質(zhì)時,亦具有廣泛的適用性。
樣品架:
這里介紹的樣品架是為數(shù)字光片(DLS)成像設(shè)計的,但同樣適用于傳統(tǒng)的直立式和倒置式顯微鏡成像。
簡介:
在使用SP8 DLS模塊進行成像時,樣品被放置在TwinFlect鏡子之間。
X方向的移動范圍由所使用的TwinFlect鏡子的距離(2.5毫米、5毫米或7.8毫米)決定。最大移動范圍大約是鏡子之間距離的一半。
圖 1:由 TwinFlect 鏡子定義的 x 方向移動范圍。y 方向的移動范圍由安裝盤的大小決定。
Y方向的移動范圍則由樣品架的形狀和大?。ㄈ缗囵B(yǎng)皿)決定。
對于標(biāo)準(zhǔn)的35毫米培養(yǎng)皿(玻璃底直徑20毫米),Y方向的移動范圍相對有限,不會接觸到皿的邊緣:
圖 2:使用標(biāo)準(zhǔn) 35 毫米培養(yǎng)皿時 y 方向的受限移動范圍。
使用矩形24 x 50毫米蓋玻片的樣品夾時,Y方向的移動范圍增加,使得可以使用更大或更長的樣品。此外,這種設(shè)計還能夠增加在一次實驗中成像的樣品數(shù)量,非常適合多位置實驗。
圖 3:矩形 24 x 50 mm 蓋玻片在 y 方向上的行程范圍增加。
材料與方法
安裝框架套件(#158007063)包含一個用于24 x 50毫米玻璃蓋玻片的樣品夾,以及一個用于直徑30毫米圓形蓋玻片的樣品夾。請注意,玻璃蓋片不包含在內(nèi)。
圖 4:安裝框架套件(樣品夾矩形 24 x 50 mm + 直徑 30 mm 的圓形樣品夾)
24 x 50 mm 蓋玻片的樣品夾僅與以下 z-Galvo 載物臺插入件兼容:
158004118 可旋轉(zhuǎn)插入件反向
158004119 通用插入件
封閉樣品架/附加玻璃蓋片
對于在水溶液中的成像,可以使用硅膠(如Elastosil® 43,Wacker)或雙組分Twinsil®來附加玻璃蓋片。
這些樣品架也適用于在更具侵蝕性的溶液中成像,例如BABB(苯甲醇/苯甲酸芐酯)。由于BABB可以溶解多種材料,因此需要使用專門類型的硅膠來密封容器,例如Elastosil® E41(Wacker)(與德國維爾茨堡大學(xué)魯?shù)婪颉ぞS爾喬中心的尤爾根·皮內(nèi)克的個人溝通)。
1
在樣品架底部的凹槽內(nèi)緣涂抹硅膠/雙硅膠。
2
添加一片玻璃蓋片,并輕輕按壓以確保其均勻貼合,以便在所有點上形成良好的密封。
3
要檢查腔體密封,請在樣品架中加入一些蒸餾水,看看是否有泄漏發(fā)生。
上樣
在組裝好帶有相應(yīng)玻璃蓋片的安裝框后,您可以選擇以下不同的樣品安裝方式:
基于瓊脂糖的上樣
1
在蓋片表面覆蓋一層薄薄的瓊脂糖(0.5-1毫米),待其聚合后,形成樣品的支撐層。
2
然后將您的樣品懸浮在液體瓊脂糖中,放置在支撐層上
3
將您的樣本(理想情況下呈一條直線)對齊以進行成像
4
從側(cè)面去除多余的瓊脂糖以為鏡子留出空間。
U 型玻璃毛細(xì)管
按照《科學(xué)實驗室》文章中描述的協(xié)議進行:DLS 樣品準(zhǔn)備:使用 U 型玻璃毛細(xì)管進行樣品安裝。
用于固定清理組織的超級膠水
更大的(已透明化的)樣本在直接粘貼到玻璃蓋玻片上時,可以與樣本架一起使用。
圖5展示了在標(biāo)準(zhǔn)玻璃底培養(yǎng)皿中安裝組織樣本的一種簡單方法。
客戶申請 DLS 準(zhǔn)備
在通過光片顯微鏡掃描的 ECi 透明化腎臟的一部分中,以實現(xiàn)3D 腎小球的可視化。感謝海德堡大學(xué)曼海姆醫(yī)學(xué)院的Norbert Gretz教授。
參考文獻:
1.Huang J, Brenna C, Khan AUM, Daniele C, Rudolf R, Heuveline V, Gretz N , A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging, Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):521
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