膜片鉗技術(shù)簡介
離子通道的生理學(xué)一直是神經(jīng)科學(xué)家感興趣的一個重要話題。誕生于1970年代的膜片鉗技術(shù)開啟了電生理學(xué)家的新時代。它不僅可以對整個細(xì)胞進(jìn)行高分辨率電流記錄,還可以對切下的細(xì)胞膜片進(jìn)行高分辨率電流記錄。甚至可以研究單通道事件。然而,由于需要復(fù)雜且高靈敏的設(shè)備,廣泛的生物學(xué)背景和高水平的實驗技能,電生理學(xué)仍然是zuiju挑戰(zhàn)性的實驗室方法之一。
歷史背景
從18世紀(jì)路易吉·伽伐尼(Luigi Galvani)的開創(chuàng)性工作開始,到19世紀(jì)埃米爾·杜布瓦-雷蒙德(Emil du Bois-Reymond)、約翰內(nèi)斯·彼得·穆勒(Johannes Peter Müller)和赫爾曼·馮·亥姆霍茲(Hermann von Helmholtz)的工作,質(zhì)膜和細(xì)胞的興奮性一直是神經(jīng)系統(tǒng)研究的主要興趣[1]。艾倫·勞埃德·霍奇金(Alan Lloyd Hodgkin)和安德魯·赫胥黎(Andrew Huxley)在1952年使用電壓鉗技術(shù)揭示了動作電位的離子通道事件,并于1963年因其杰出的工作而獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎[2,3]。
那時,電壓鉗僅能用于相當(dāng)大的細(xì)胞,因為需要鋒利的微電極來穿透質(zhì)膜。在1970年代末,貝爾特·薩克曼(Bert Sakmann)和埃爾文·內(nèi)爾(Erwin Neher)改進(jìn)了電壓鉗技術(shù),并且shouci解析了青蛙骨骼肌膜片上的單離子通道電流。他們因此榮膺1991年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎[4,5]。下一個突破則是貝爾特·薩克曼(Bert Sakmann)在1980年發(fā)明的高阻封接,極大地提高了信噪比,并允許記錄更小的電流[6]。
電生理學(xué),最初誕生在特殊的生物物理實驗室,現(xiàn)在已經(jīng)擴(kuò)展到基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,并成為研究神經(jīng)系統(tǒng)中單個細(xì)胞或整個細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)行為的最重要工具之一。
膜片鉗技術(shù)的一般原理
圖1:膜片鉗記錄的一般原理:含有電解質(zhì)溶液的玻璃管緊密封接到細(xì)胞膜上,從而實現(xiàn)膜片的電隔離。因此流經(jīng)該膜片中離子通道的電流會流入微電極,然后通過鏈接到高靈敏度差分放大器的電極進(jìn)行記錄。在電壓鉗配置中,電流通過負(fù)反饋環(huán)路注入細(xì)胞,以補(bǔ)償細(xì)胞膜電位的變化。記錄該電流可以得出有關(guān)細(xì)胞膜電導(dǎo)性的結(jié)論。
膜片鉗技術(shù)可以研究若干,甚至單個離子通道[7]。因此,它引起了興奮類細(xì)胞研究工作的極大興趣,例如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和肌纖維。[8]
單個離子通道每秒可以傳導(dǎo)約1000萬個離子。不過,電流僅有幾皮安。記錄這種數(shù)量級的電流不僅對研究人員,對于設(shè)備而言同樣ji具挑戰(zhàn)。原理是將帶有鈍端的薄玻璃或石英管密封在膜上(參見圖1、2和3)。
施加吸力可以產(chǎn)生千兆歐姆級別的高阻抗封接。這種緊密封接可以對膜片進(jìn)行電隔離,這意味著流過膜片的所有離子都會流入微電極,并借助連接到高靈敏度電子放大器的氯化銀線電極((Ag/AgCl)電極)記錄。浴電極用于設(shè)置零電平。
為了防止細(xì)胞膜電位發(fā)生變化,放大器會產(chǎn)生類似于流經(jīng)細(xì)胞膜電流的補(bǔ)償電流,作為負(fù)反饋機(jī)制(參見圖1)。
測量細(xì)胞的膜電位并將其與指令電位進(jìn)行比較。如果指令電位和測量值之間存在差異,則會注入電流。該補(bǔ)償電流將記錄下來,并可以得出有關(guān)膜電導(dǎo)的結(jié)論。膜電位可以獨(dú)立于離子電流進(jìn)行操縱,這種能力可以研究膜通道的電流-電壓關(guān)系。
圖2:微電極貼附到培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜的相差圖像。圖片來自德國波鴻魯爾大學(xué)的Ainhara Aguado博士提供。
膜片鉗配置
根據(jù)研究對象,可以使用不同的配置。在細(xì)胞貼附模式下,膜片保持完整(參見圖3)。松散貼片是細(xì)胞貼附模式的修改版。這種情況下,移液器沒有緊密封接在細(xì)胞膜上,而是松散地貼附在細(xì)胞膜上。該模式通常用于記錄神經(jīng)元細(xì)胞中的動作電位。它的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞質(zhì)的成分不受影響。不過,另一方面,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境無法控制。
通過電極微管施加造孔劑(通常為抗生素)會產(chǎn)生穿孔膜片來保證離子連續(xù)性,同時細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)不會被電極液洗掉。zui常用的膜片鉗模式是全細(xì)胞模式(參見圖3)。要實現(xiàn)這種模式,通過短暫施加強(qiáng)吸力來破壞膜片。微電極內(nèi)部與細(xì)胞質(zhì)連為一體。該方法用于記錄來自整個細(xì)胞的電位和電流。對于全細(xì)胞測量方式,研究人員有兩種配置方式可供選擇:電壓鉗模式,其中電壓保持恒定并記錄電流,或者電流鉗模式,其中電流保持恒定并觀察膜電位的變化。
此外,也可以僅記錄來自小塊而不是整個細(xì)胞的電流。這增加記錄單個離子通道的機(jī)會。膜片可以根據(jù)微電極內(nèi)部的兩個不同方向確定方位。為實現(xiàn)內(nèi)面向外的配置,微電極貼附在細(xì)胞膜上,并且可以收回以撕下一小片膜(圖3)。本例中,細(xì)胞膜的胞質(zhì)表面暴露在外面。這種方法通常用于研究單個通道的活性,優(yōu)點(diǎn)在于可以調(diào)整暴露在細(xì)胞內(nèi)表面的培養(yǎng)基。
如果希望研究細(xì)胞外誘因(如神經(jīng)遞質(zhì))的影響,則應(yīng)選擇外面向外的配置(參見圖3)。這種情況下,移液器在全細(xì)胞測量配置中收回,導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂并重組。在該配置中,細(xì)胞外表面暴露,因此可以輕松應(yīng)用細(xì)胞外誘因。
貼片鉗的四種記錄方法
圖3:貼片鉗的四種記錄方法。細(xì)胞連接。當(dāng)移液器zui接近細(xì)胞膜時,施加輕微的吸力以獲得移液器和細(xì)胞膜之間的緊密密封。全細(xì)胞。通過施加另一個短暫但強(qiáng)烈的吸力,細(xì)胞膜被破裂,移液管獲得進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的機(jī)會。由內(nèi)向外:在細(xì)胞連接模式下,移液器被縮回,貼片與膜的其他部分分離,暴露在空氣中。膜的細(xì)胞質(zhì)表面被暴露出來。外側(cè):在全細(xì)胞模式下,移液器被縮回,導(dǎo)致兩小塊膜重新連接,形成一個小的囊狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜的細(xì)胞膜面朝向移液器溶液。源于此。如果你能給我打補(bǔ)丁--什么是補(bǔ)丁夾子技術(shù)?
要求
膜片鉗實驗適用于培養(yǎng)細(xì)胞、急性解離細(xì)胞或者急性振動切片,從而研究細(xì)胞在其自然環(huán)境中的電生理學(xué)特性。感興趣的離子通道也可以在通用細(xì)胞系(HEK293、CHO、LNCaP)中分離并異質(zhì)表達(dá)。
根據(jù)樣品不同,需要使用倒置(培養(yǎng)細(xì)胞)或者具有穩(wěn)定平臺的正置固定載物臺顯微鏡(切片樣品)。如果要研究急性切片中的細(xì)胞,建議使用紅外DIC(微分干涉對比)顯微鏡[9],后者可以更加方便地觀察細(xì)胞膜。顯微鏡應(yīng)放置在防振臺上,因為任何移動都可能對微電極和細(xì)胞膜之間的封接造成致命影響。
需要使用顯微操作臂來精確移動微電極。加熱并拉長小型玻璃或石英毛細(xì)管可以形成極細(xì)的微電極管。電極管吸頭的直徑約為1微米,其中包含的膜片僅含幾個(甚至一個)離子通道。微電極管吸頭需要在熔融狀態(tài)進(jìn)行熱拋光,以便在吸頭接觸到細(xì)胞膜后實現(xiàn)高阻抗封接。電極管中含有類似于胞外溶液或細(xì)胞質(zhì)的溶液,具體取決于記錄模式。微電極安裝在顯微操作臂上,可以向細(xì)胞膜精準(zhǔn)移動。
為了檢測電流,使用了氯化銀線。同樣采用氯化銀線(作為銀/氯化銀電極)的浴電極設(shè)置為零電流值。帶低噪聲晶體管的差分放大器連接到計算機(jī),以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和數(shù)字化,可以采購特定軟件來控制該放大器并分析數(shù)據(jù)?;蛘?,可以使用示波器來監(jiān)測電流。如有需要,可以為該配置添加灌注系統(tǒng)。特定物質(zhì)可以通過灌注筆或使用POC(灌注開關(guān))室添加。
視頻:
制備急性腦切片
該視頻顯示使用振動切片機(jī)制備小鼠腦切片的過程。視頻展示了整個工作流程,從一開始使用立體顯微鏡進(jìn)行解剖、嵌入低膠凝溫度瓊脂糖,到切片。
視頻:
急性腦切片的電生理研究
本視頻展示了使用固定載物臺顯微鏡對急性腦切片進(jìn)行電生理測量的工作流程。
視頻:
培養(yǎng)細(xì)胞的電生理研究
本視頻展示了使用倒置顯微鏡對熒光培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行電生理學(xué)研究的典型工作流程,從準(zhǔn)備膜片鉗電極開始,到使用顯微鏡進(jìn)行實際測量結(jié)束。
參考文獻(xiàn):
1.Areles Molleman, Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology, John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, (2003)
2.Bertil Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, Sinauer Associates Inc. (2001)
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