腦類器官使得人類大腦發(fā)育的機(jī)制研究成為可能,并提供了在不受限制的發(fā)育系統(tǒng)中探索自我組織形成的機(jī)會,類器官的成像觀察是理解其微觀結(jié)構(gòu)和功能的重要手段(文獻(xiàn)1)。由于人腦類器官的尺寸較大,組織致密,發(fā)育緩慢,且在幾周到幾個月的發(fā)育過程中需要無菌成像條件,使得對人腦類器官的活體成像特別是長時間,面臨巨大挑戰(zhàn)。
在本例中,作者建立了長期的活體光片顯微鏡技術(shù),應(yīng)用于由熒光標(biāo)記的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的無指導(dǎo)腦類器官,這使得我們能夠在類器官發(fā)育的數(shù)周內(nèi)跟蹤組織形態(tài)、細(xì)胞行為和亞細(xì)胞特征,為研究人類大腦形態(tài)動力學(xué)提供了新的途徑,并支持基質(zhì)相關(guān)的機(jī)械感知動態(tài)在大腦區(qū)域化過程中發(fā)揮核心作用的觀點(diǎn)。
稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類器官的
長期活體成像
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外源性細(xì)胞外基質(zhì)影響大腦類
器官的形態(tài)發(fā)生
為了量化類器官之間的形態(tài)動態(tài)變化,作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點(diǎn)、多視角的成像能力,一次成像并行記錄16個類器官通過統(tǒng)計(jì)分析不同時間點(diǎn)類器官體積、腔室體積和腔室數(shù)量,結(jié)果突出了早期大腦類器官發(fā)育的三個形態(tài)動力學(xué)階段,包括:
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快速組織和腔體生長的早期階段
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涉及腔體融合事件的組織穩(wěn)定階段
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神經(jīng)上皮成熟的最終階段
對比用基質(zhì)膠、低熔點(diǎn)瓊脂糖和不使用任何外源基質(zhì)培養(yǎng)類器官,使用光片長時間跟蹤類器官動力學(xué),結(jié)果顯示外源細(xì)胞外基質(zhì)的存在對人腦類器官的組織尺度形態(tài)發(fā)生有重大影響,且改變的組織極性可能會影響成熟神經(jīng)上皮中的細(xì)胞形態(tài)動力學(xué)。
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單細(xì)胞形態(tài)類型分析揭示了發(fā)育中的
類器官內(nèi)形狀的轉(zhuǎn)變
研究人員利用多位點(diǎn)標(biāo)記的質(zhì)膜、肌動蛋白、微管、核膜和組蛋白評估細(xì)胞形態(tài)變化在早期大腦類器官發(fā)育過程中對細(xì)胞的影響。通過開發(fā)的圖像分析流程:圖像預(yù)處理→亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分割→結(jié)構(gòu)預(yù)測→特征提取→解多通道→形態(tài)特征分析,揭示了兩個主要的核(組蛋白、層粘連蛋白)和細(xì)胞(肌動蛋白、微管、膜)結(jié)構(gòu)組。
通過高分辨率聚類,將結(jié)構(gòu)分組為形態(tài)類型,即具有相似形態(tài)特征(如體積、曲率、軸長的細(xì)胞簇,使用PAGA軌跡分析識別組織中的結(jié)構(gòu)變化梯度,量化了多能干細(xì)胞向早期神經(jīng)外胚層的過渡,基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和組織拓?fù)渥兓纬沙墒斓纳窠?jīng)上皮。
通過對每種基質(zhì)條件(基質(zhì)膠、瓊脂糖和無外源基質(zhì))下,對每一天成像的類器官進(jìn)行標(biāo)記結(jié)構(gòu)的分割以及形態(tài)學(xué)分類分析,結(jié)果表明在沒有基質(zhì)膠作為外部細(xì)胞外基質(zhì)的情況下生成的類器官在組織拓?fù)渖习l(fā)生了變化,包含更大比例的非排列和非延長細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)類型的異質(zhì)性更高,并且未形成均勻的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)上皮。
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矩陣通過調(diào)節(jié) WNT 通路影響類器官的
形態(tài)發(fā)生和模式形成
為了理解在不同基質(zhì)條件(基質(zhì)膠、瓊脂糖、無矩陣)下生長的類器官中發(fā)展出的分子細(xì)胞狀態(tài),我們對第 13 天的類器官進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析,差異表達(dá)基因的基因本體分析顯示出多個信號通路的富集,包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號通路以及與肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。
基質(zhì)膠誘導(dǎo)的神經(jīng)外胚層的強(qiáng)烈形態(tài)變化,以及在無基質(zhì)條件下 WNT 和 Hippo 信號通路的上調(diào),測試了YAP調(diào)節(jié)對類器官發(fā)育的影響。綜合證實(shí)了我們應(yīng)用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel,導(dǎo)致腔體擴(kuò)張并自我模式化為主要的頭側(cè)前腦區(qū)域,并且 YAP1 的激活和 WLS 表達(dá)水平的增加促進(jìn)了發(fā)育中的神經(jīng)上皮的尾部化。
在對人類早期腦類器官的形態(tài)動力學(xué)研究中,Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性,通過多視角、多位置、長時程的活細(xì)胞成像,展現(xiàn)腦類器官的整個發(fā)育過程。在單次長時程成像過程中,同時收集多個樣本在不同條件下的數(shù)據(jù),結(jié)合自我開發(fā)的分析流程、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析、信號通路探索分析,展示了YAP1 在基質(zhì)介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生和類器官模式化中發(fā)揮的作用。
總的來說,這一應(yīng)用案例為理解類器官發(fā)育的形態(tài)動力學(xué)提供了技術(shù)進(jìn)步,提供了對基質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)上皮信號通路的機(jī)制性見解,并為未來探索人類大腦發(fā)育過程中細(xì)胞外微環(huán)境鋪平了道路。
參考文獻(xiàn):
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023
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